Q1:没有克隆?

A:每批次的HIT感受态细胞经过严格的质检才会出厂。每盒感受态细胞中都有control plasmid,请进行对照实验,若还是没有转化克隆,请分析下列可能原因:

1) 确认是否严格按操作说明进行转化实验? 因为我们的HIT感受态细胞操作过程有别于传统的感受态,只需要放置冰上几分钟,无需热刺 激和复苏步骤。

2) 确认温度是否严重失控,培养箱温度38℃以上? HIT感受态细胞有操作简便的优越性,同时对温度比较敏感,我们建议,宁 愿培养是温度低点 (37℃以下),而不要超过38℃。

3) 若转化连接产物,请确认是否连接上?

4) 若以上原因都排除,请联系上海逍鹏生物或 ViVaCell 经销商。

Q2: 转化效率低?

A:感受态细胞没有达到预期的转化效率,可能原因有:

1) 确认是否严格按操作说明进行转化实验?

2) 是否抗生素用量偏高(Ampicillin >50ug/ml, Kanamycin >25ug/ml)? 由于HIT感受态细胞处理过程与传统方法不一致,对选择性培养基抗生素要求浓度较低。抗生素的浓度建议如下: Ampicillin (50 mg/ml) ; Kanamycin (25mg/ml); Tetracycline (12.5 mg/ml)。

3) 质粒太大? 对于较大质粒(>6 kb)与 cDNA 库操作步骤, 请将标准步骤中冰浴静置 1-10min 改为冰浴 20min,然后42℃水浴 1min,再冰浴 20min,将有助于提高转化效率。

4)平板是否4℃拿出直接使用? 建议培养皿与涂布玻璃珠预热至37℃,使用4℃或室温平板时,效率会降低。

Q3: 是否可以直接转化连接产物?

A:一般情况下可以直接转化。若要求转化效率高,则需纯化连接产物,即清除连接产物中的连接酶、 PEG等。常规克隆,将连接溶液稀释3倍后取1ul. 确保转化的DNA不超过10ng, 否则转化效率将急剧 下降。确保加入的连接产物不超过感受态细胞体积的1/10。

Q4: 使用涂布玻璃珠与玻璃棒的区别?

A:使用涂布玻璃珠比使用玻璃棒转化效率较高,而且可以同时涂布多个平板,简便操作流程。

Q5: 涂布玻璃珠与平板的温度对转化效率是否有影响?

A:将涂布玻璃珠与平板的温度预热至37°C再使用,转化效率更高。

Q6: 对于大质粒,是否必须更改标准操作步骤?

A:对于转化较大质粒(>6 kb)与cDNA libraries (vector + insert >6 kb), 可以按照标准步骤操作, 若是转化效率下降太多,则请将标准步骤中冰浴静置1-10min改为冰浴20min, 42°C热击1min,再冰 浴20 min。

Q7: 抗生素浓度对转化效率是否有影响?

A:HIT-DH5α: LB + Ap 50-60 μg/μl 转化效率是 LB + Ap 100 μg/μl 的2-3倍. 培养 11∽16 小时 可以看到克隆, 但是超过18小时将出现卫星克隆。

Q8: 质粒的大小对转化效率是否有影响?

A:转化效率 = 克隆数/质粒质量 (μg). 例如109 感受态细胞使用2.7-kb plasmids转化效率达到1.6 ∽5.5 x 109/μg, 但是使用 10.0-kb plasmids 转化效率降为4.0∽9.0 x 106/ μg。

Q9: 怎样减少卫星克隆的出现?

A:若出现卫星菌落,我们建议: 1) 将涂板玻璃珠与平板预热至37℃再使用; 2) 平板是否放置时间太长,抗生素失效?请选用近期制作的平板; 3) 抗生素浓度建议如下:Ampicillin (50 mg/ml) ; Kanamycin (25 mg/ml) ; Tetracycline (12.5 mg/ml); 4) 建议孵育时间不要超过18小时。

Q10: 平板出现雾状原因?

A:若平板出现雾装,可能原因为平板未晾干,直接涂板。 我们建议您先将平板晾干,预热至37℃再涂板。